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包含體蛋白質(zhì)提取和純化的原理和操作步驟

發(fā)布時間:2023/7/11點擊次數(shù):2244

簡介

在利用大腸埃希菌表達(dá)重組蛋白時,經(jīng)常會得到包含體。包含體分離純化難度大,只有在變性后才能形成可溶性的形式予以純化。純化后的變性蛋白質(zhì)需要重新復(fù)性(renaturation),才能折疊成正確的天然構(gòu)象和恢復(fù)原有的生物活性。

原理

包含體是細(xì)胞感染病毒后胞漿或核中出現(xiàn)的特殊結(jié)構(gòu)。 常用于病毒病的診斷。 根據(jù)病毒種類,包含體表現(xiàn)大小不一,形態(tài)各異,單一或多個,嗜酸或嗜堿。 它代表著病毒粒子的合成場所,故又稱病毒工廠(virus factory)或病毒原質(zhì)體(viroplasma)。包含體分離純化難度大,只有在變性后才能形成可溶性的形式予以純化。純化后的變性蛋白質(zhì)需要重新復(fù)性(renaturation),才能折疊成正確的天然構(gòu)象和恢復(fù)原有的生物活性。

材料與儀器

試劑:

 

溶菌酶、EDTA、Tris、去垢劑 Triton X-100、尿素

 

儀器:

 

超聲破碎儀、離心機(jī)、凝膠層析柱、透析袋

步驟

(一)裂菌、洗滌及溶解

 

1.裂菌利用溶菌酶破碎細(xì)菌的細(xì)胞膜,再結(jié)合超聲破碎方法裂解細(xì)菌。細(xì)菌裂解后,500020000 g 離心 15 分鐘,可以使大多數(shù)包含體沉淀,與可溶性蛋白分離開。

 

2.洗滌為了棄除包含體上黏附的雜質(zhì),通常用低濃度的變性劑,如含 2mol/L 尿素的 1 mmol/LEDTA50 mmol/L Tris,pH7.08.5)洗滌。過高濃度的尿素或鹽酸胍會使包含體溶解。溫和的去垢劑 Triton X-100 和脫氧膽酸也可以棄除膜碎片和膜蛋白。

 

3.溶解利用 68 mol/L 尿素或 58 mol/L 鹽酸胍將包含體溶解。鹽酸胍是強于尿素的變性劑。

 

(二)變性蛋白質(zhì)的復(fù)性

 

1.復(fù)性過程蛋白質(zhì)在尿素濃度為 4 mol/L 時開始復(fù)性,到 2 mol/L 時復(fù)性結(jié)束。對于鹽酸胍而言,從濃度為 4 mol/L 開始復(fù)性,到 1.5 mol/L 時復(fù)性結(jié)束。常用的包含體蛋白質(zhì)復(fù)性方法有疏水層析柱復(fù)性和凝膠層析柱復(fù)性兩類。凝膠層析柱復(fù)性均用 Sephacryl S-100 Superdex 75 等層析介質(zhì),層析柱的長度為 40100 cm。層析柱復(fù)性回收率高(高達(dá) 90% 以上)、速度快、易于放大、樣品稀釋倍數(shù)小(一般 5 倍左右)。

 

2.復(fù)性效率蛋白質(zhì)復(fù)性取決于蛋白質(zhì)本身的特性以及所處的環(huán)境。有些蛋白非常容易復(fù)性,如牛胰 RNA 酶的復(fù)性效率可以達(dá)到 95% 以上,但有一些蛋白至今還沒有發(fā)現(xiàn)能夠使其復(fù)性到天然構(gòu)象的理想方法。純化白細(xì)胞介素-2 時,以 SDS 溶液中加入銅離子(0.05% SDS7.530 μmol/L CuCl2)的方法,2537 ℃ 下反應(yīng) 3 小時,再用 1 mmol/L EDTA 終止反應(yīng),復(fù)性后的二聚體低于 1%。一般說來,蛋白質(zhì)的復(fù)性效率應(yīng)在 20% 左右。

 

3.影響復(fù)性效率的因素復(fù)性緩沖液的最適 pH 8.09.0,最適溫度為 4 ℃,復(fù)性時間一般為 2436 小時。復(fù)性時的蛋白質(zhì)濃度應(yīng)該控制在 0.10.5 mg/ml,過高的濃度會影響到復(fù)性。在磁力攪拌下,逐滴將變性的蛋白質(zhì)加入復(fù)性液中,使變性的蛋白質(zhì)在復(fù)性緩沖液中始終處于低濃度狀態(tài)。如果過快地將變性蛋白質(zhì)加入到復(fù)性緩沖液中,容易形成絮狀沉淀,這是蛋白質(zhì)重新凝聚的前兆。

 

復(fù)性完畢后,蛋白質(zhì)要裝入透析袋,在低濃度的緩沖液中連續(xù)緩慢透析 1224 小時;透析不能太快;透析前后均要離心。

 

4.提高包含體蛋白復(fù)性產(chǎn)率的方法在包含體蛋白質(zhì)復(fù)性過程中,加人促進(jìn)劑可以增加折疊復(fù)性中間體的溶解性,導(dǎo)致形成穩(wěn)定的、具有正確天然結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)。

 

1)添加氧化交換系統(tǒng):對于含有二硫鍵的蛋白,復(fù)性過程通過氧化交換系統(tǒng)可以促使不正確的二硫鍵配對發(fā)生快速交換反應(yīng),從而提高了正確配對的二硫鍵的產(chǎn)率。常用的氧化交換系統(tǒng)有谷胱甘肽/氧化型谷胱甘肽(GSH/GSSG)、DTT/GSSG 等,其中 GSH/GSSG 最為常用。通常使用 13 mmol/L 還原型巰基試劑,還原型和氧化型巰基試劑的比例通常為 10:15:1。

 

2)添加小分子化合物:小分子化合物通過破壞錯誤折疊中間體的穩(wěn)定性,或增加折疊中間體和未折疊分子的可溶性來提高復(fù)性產(chǎn)率,如鹽酸胍、脲、烷基脲以及碳酸酰胺類等,在非變性濃度下是很有效的促進(jìn)劑。蛋白質(zhì)的輔助因子 Zn  Cu 可以穩(wěn)定蛋白質(zhì)的折疊中間體,防止蛋白質(zhì)的聚集。濃度大于 0.4 mol/L Tris 緩沖液可提高包含體蛋白質(zhì)的折疊效率,濃度為 0.40.6 mol/L L-Arg 有助于增加復(fù)性中間產(chǎn)物的溶解度。硫代甜菜堿類物質(zhì)(non-detergent sulfobetaines,NDSBs)是近年來出現(xiàn)的可促進(jìn)蛋白復(fù)性的新家族,NDSBs 由一個親水的硫代甜菜堿及一個短的疏水基團(tuán)組成,不屬于去垢劑,易于透析去除。目前常用的有 NDSB-195,NDSB-201 NDSB-256。

 

3)添加分子伴侶和折疊酶:研究得比較透徹的分子伴侶有 Hsp60/GroE Hsp70/DnaK。折疊酶包括硫氧還蛋白二硫鍵異構(gòu)酶、肽酰輔氨酰順反異構(gòu)酶等。但這類蛋白在折疊復(fù)性后要除去,而且十分昂貴,因此采用可回收利用的方法如固定化法為好。

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