質(zhì)粒構(gòu)建是指選定的目的外源基因（DNA）先要經(jīng)過PCR擴(kuò)增。隨后用限制性內(nèi)切酶分別切割載體和外源DNA片段，再使用DNA連接酶將切割后的載體與DNA片段連接，轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞。最后經(jīng)過篩選鑒定出正確的重組克隆質(zhì)粒，實現(xiàn)目的基因在宿主細(xì)胞內(nèi)的正確表達(dá)。那么質(zhì)粒構(gòu)建實驗影響因素有哪些呢？讓我們一起來看看吧！

一、載體的選擇

在選擇克隆載體時應(yīng)注意以下幾點：

①具有自主復(fù)制能力，拷貝數(shù)高；

②攜帶易于篩選的選擇標(biāo)記；

③含有多種限制酶的單一識別序列，以供外源基因插入；

④載體應(yīng)盡可能?。ǎ?5kb），便于導(dǎo)入細(xì)胞和進(jìn)行繁殖；

⑤使用安全?？寺≥d體應(yīng)只存在于有限范圍的宿主內(nèi)，在宿主體內(nèi)不進(jìn)行重組，不發(fā)生轉(zhuǎn)移，不產(chǎn)生有害性狀，并且不能離開工程宿主自由擴(kuò)散。

二、引物設(shè)計注意事項

在構(gòu)建質(zhì)粒時，設(shè)計引物時應(yīng)該考慮引物長度、引物的GC含量、引物的Tm值等因素，并避免引物間出現(xiàn)配對突變或二次結(jié)構(gòu)等情況。

前向引物：5’端 -- 上游克隆載體末端同源序列 + 基因正向擴(kuò)增引物 --3’端

反向引物：3’端 -- 基因反向擴(kuò)增引物 + 下游克隆載體末端同源序列 --5’端

運用PCR擴(kuò)增目的基因的過程中，引物設(shè)計注意事項：

① 引物長度最好在18-30bp左右，常用的長度是 20-22bp；

②引物 Tm 值最好在 60℃ 左右，兩條引物間 Tm 值要保持接近，相差最好不要超過 5°C；

③GC 的含量標(biāo)準(zhǔn)通常為 40%-60% 或45-55%；

④引物自身不應(yīng)含有連續(xù)超過4個的互補(bǔ)的堿基，避免形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)或形成引物二聚體；

⑤引物的3’端要避免出現(xiàn)連續(xù)重復(fù)的堿基，如 GGG 或 CCC ，這會導(dǎo)致錯配的發(fā)生，最后一個堿基最好是 G 或 C；

⑥在引物的 5’端添加酶切位點時（在不影響擴(kuò)增的特異性的前提下），根據(jù)酶切位點序列，需要添加不同種類和數(shù)量的保護(hù)堿基，通常多加3個堿基即可滿足保護(hù)酶切位點的需求；

⑦上下游引物最好加入不同的酶切位點，相同的酶切位點可能導(dǎo)致目的基因片段出現(xiàn)倒置連接現(xiàn)象，影響基因序列的正常表達(dá)。

三、酶切位點的選擇

選擇合適的剪切酶和連接酶對于質(zhì)粒構(gòu)建至關(guān)重要。剪切酶的選擇應(yīng)該考慮酶切位點的位置、酶的反應(yīng)條件等因素。連接酶的選擇應(yīng)該根據(jù)所用的質(zhì)粒載體和目的基因的大小來確定。

①選擇質(zhì)粒上兩個酶切位點的距離不應(yīng)小于太?。?gt;10bp），否則影響限制性內(nèi)切酶對切點的識別，不利于空載體的雙酶切。

②一般目的基因用于克隆表達(dá)的情況下，酶切位點的選擇要考慮到：

目的基因片段內(nèi)部不含有所選的酶切位點（不然鑒定陽性重組子雙酶切時會將目的基因切斷）。

③實驗后繼應(yīng)用的所有載體（真核、原核、酵母、昆蟲）都盡可能含有所選的酶切位點。并且要保證在載體上的插入方向正確（定向克?。?。（不然換載體表達(dá)時，還要重新設(shè)計引物，以引進(jìn)新的酶切位點）。

④盡可能選比較常用的酶切位點（常用切點酶的價格比較便宜）。

⑤兩個酶切點至少隔上3個堿基。

⑥兩個酶切點最好不要是同尾酶（切下來的殘基不要互補(bǔ)），否則效果相當(dāng)于單酶切。

⑦最好使用酶切效率高的酶。

⑧最好使用雙酶切有共同buffer的酶。

⑨在操作酶切連接的步驟時也要定性定量，保證酶活性充足。

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